Q：RNase H活性對反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響？

A：RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA 雜交體中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一鏈cDNA 合成反應(yīng)中DNA/RNA 雜交體中模板RNA被降解，從而保證第一鏈cDNA 的合成量和長度。

Q：不同溫度下的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)有何差別？

A：一般的反轉(zhuǎn)錄酶的適宜反應(yīng)溫度是42℃，但是對于某些GC含量高的基因或二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因，在42℃不足以打開二級結(jié)構(gòu)，使cDNA合成無法順利進(jìn)行。此時(shí)需要用耐高溫的反轉(zhuǎn)錄酶，如TransScript ? II RT或TransScript ?-Uni RT，在高溫 (≤55℃或≤65℃)條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得較好的結(jié)果。

Q：RT-PCR后，無PCR產(chǎn)物的原因？

A：在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前一定要電泳驗(yàn)證RNA的完整性，確認(rèn)RNA沒有降解。RNA不要保存時(shí)間過長，盡快進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR操作。

Q：基因克隆測序后經(jīng)常發(fā)生突變的原因？

A：從cDNA進(jìn)行基因克隆時(shí)，突變有可能發(fā)生在反轉(zhuǎn)錄過程，也可能發(fā)生在PCR過程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)不要太高；可通過增加模板量、減少循環(huán)數(shù)降低突變機(jī)率。為保證反轉(zhuǎn)錄時(shí)的保真性，請選擇保真性高的反轉(zhuǎn)錄酶。

Q：RT-PCR時(shí)模板一般使用多少？

A：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μl時(shí)，用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR用1/20-1/10 PCR體積 (2.5-5μl) 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板 (50μl反應(yīng)體系)。